艾问艾答 | 一张表看懂你的实验该用直接免疫荧光还是间接免疫荧光检测
这天，小艾正在试验台前一心一意、挥动双手、八面玲珑的时候……微信响了，原来是实验室的师弟，他正在设计新的实验，可在选择检测方法时犯了选择困难症。
他不确定该使用直标一抗进行直接检测还是通过标记二抗进行间接检测。小艾准备借着这个机会顺便考考师弟对实验理解到了第几层。
看来师弟还是刚入门、知其然不知其所以然的状态啊。
师弟对直接免疫荧光法和间接免疫荧光法的解释没错，直接和间接法不仅仅限于免疫荧光，它们也与其它依赖于荧光染料、酶或有色粒子偶联抗体的技术相关，例如流式细胞术、ELISA和免疫组化等。
但这两种方法是有区别的。如下表所示，两种方法各有其利弊：
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直接 |
间接 |
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时间 |
直接法实验方案通常较短，因为它只需要一个标记步骤。 |
使用偶联二抗检测一抗会增加额外的操作步骤。 |
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成本 |
偶联一抗通常比未偶联一抗更贵。 |
与一抗相比，二抗相对更便宜。使用相同的偶联二抗检测不同的一抗能进一步节约成本。 |
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复杂度 |
直接法的实验方案步骤较少，更简单。 |
间接方法中必须选择适当的二抗，增加了复杂度。这种情况在需要使用多个二抗的多色实验中尤为突出，每个二抗需要靶向不同的物种并偶联至不同染料。 |
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灵活性 |
市场上可获得的偶联一抗限制了灵活性。 |
不同偶联二抗的可用性大大增加了灵活性。 |
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灵敏度 |
直接法中获得的信号与间接法相比可能较弱，因为直接方法中没有使用二抗进行信号放大。 |
多个二抗结合一抗可使信号放大。 |
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物种交叉反应性 |
直接方法中，物种交叉反应被降至最低，因为荧光素已经与一抗偶联。 |
二抗可能与不是靶标的生物体发生交叉反应。使用预吸附二抗能防止交叉反应。 |
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背景 |
使用直标一抗可减少非特异性结合。 |
间接法中，含有内源性免疫球蛋白的样品可能显示高背景。 |
▲ 直接标记法只使用一种抗体，间接标记法使用两种抗体（☞点这里查看出处）
如果你有针对待测抗原的直标一抗（荧光素标记抗体），而且你的待检抗原表达丰度也比较高，做直接法也未尝不可。不过如果你不具备上述两个条件的话，还是推荐你做间接法。
比如细胞骨架蛋白，就可以用直接免疫荧光法检测；如果蛋白表达丰度比较低，直接法检测就比较困难，需要用荧光标记二抗进行信号放大来检测。
听了小艾的解释，师弟确认了靶标蛋白是高丰度的蛋白，热爱偷懒的师弟选择用直标一抗来检测，这当然可以。希望这些信息对您也有帮助哦~