艾问艾答｜WB高背景？有黑斑和气泡？小艾教您如何获得漂亮清晰的条带！

一张好看、可信的 WB 图是每个实验者心中的白月光。遥想当年，小艾刚上手实验的时候，费了老鼻子劲才做出一张条带好看的 WB，结果因为背景太高没法儿用，可把小艾气得好几天睡不着觉。

*图片来源于网络

确实有很多同学都因为 WB 背景太高或出现斑点而苦恼。看看下面这些活生生的例子。

☞点击查看图片来源

还有这个，小艾隔着屏幕都能感受到这位同学的哀嚎……

☞点击查看图片来源

惨痛的例子如此之多，那么今天小艾就来传传心得，为大家总结一下遇到这类情况该怎么办吧！

高背景

WB 出现高背景，可能由封闭不充分、一抗/二抗浓度过高、二抗的非特异性结合、洗涤不充分等原因造成。

封闭不充分

如果封闭不充分，一抗可能直接结合到膜上，造成二抗孵育时在非特异性位点发生结合。要解决这个问题，可尝试延长封闭时间，也可以尝试更换封闭液。常用的封闭剂有脱脂奶粉、BSA、血清和明胶等，Abcam 推荐用 5% 脱脂奶粉、5% BSA 或血清等室温封闭 1-2h。

封闭剂含有酪蛋白

奶粉及脱脂奶粉含有酪蛋白，由于酪蛋白会结合磷酸化抗体而易产生高背景。因此，检测磷酸化蛋白时建议用 BSA 作为封闭剂。

一抗/二抗浓度太高

如果一抗/二抗浓度太高，也会出现非特异性结合，通过洗涤也无法完全去除，从而导致高背景。遇到这种情况，建议设置多个抗体稀释梯度，以筛选出合适的抗体比例。

二抗的非特异性结合

有时候，二抗与样本或封闭剂也会存在非特异性结合。建议做实验时，设置不孵一抗、只孵二抗的阴性对照。

洗涤不充分

对于洗涤不充分，建议适当增加洗涤次数和洗涤时间，也可尝试提高洗涤液中 tween20 的含量（比如可以提高至 0.5-1%）。

其他原因

另外，通常 NC 膜比 PVDF 膜背景低。

斑点

WB 结果中出现斑点也让人抓狂，谁都想要一张干干净净像剥了壳的鸡蛋一样的WB 图。

WB 结果出现黑色斑点，最常见的原因是封闭液中出现了不溶性物质。不溶性颗粒附着在膜上，就会导致发光时候膜上出现黑点，这时建议将封闭液充分溶解后进行过滤。

☞点击查看图片来源

如果 WB 结果出现白圈（空泡），一般是由于转膜时三明治结构中间出现气泡导致的，需注意转膜时小心排出气泡。

☞点击查看图片来源

好啦，心得传授完毕，收工！希望小艾这些总结能给您帮助，也祝愿所有的实验者都有剥壳鸡蛋般的 WB 图，还有脸！