靶点解惑 | PD-L1检测总做不好？原来有这么多隐藏雷坑！
由于 PD-L1 的重度糖基化，在 Western Blot 和 IHC-P 实验中检测 PD-L1 极具挑战性。
小艾整理了在 WB 和 IHC-P 中检测 PD-L1 的技巧，帮助您成功检测到目的蛋白。
PD-L1 简介
图1. PD-L1 表达调控机制。
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PD-L1 是一个 33kD 的跨膜蛋白，在白血病、黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、肾癌及膀胱癌组织中高度表达。随着针对 PD-1/PD-L1 免疫检查点抑制剂开发的不断深入，目前已有 多 个 PD-1/PD-L1 抑制剂（Atezolizumab，Durvalumab，Avelumab，Nivolumab，Pembrolizumab，Cemiplimab等）进入临床，用于二线甚至一线治疗非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、肾细胞癌、尿路上皮癌、黑色素瘤和经典霍奇金淋巴瘤等疾病。
小艾整理了以下关于 PD-L1 的实验注意事项：
PD-L1 的 WB 检测
由于糖基化等翻译后修饰的存在，WB 检测到的条带通常在 40-60kD 附近，而不是理论上的 20-33kD，不同来源的细胞系中 PD-L1 的表达情况也不一样（图2）。小艾建议在检测中加入过表达或阳性细胞样品，确保实验体系工作正常。
图2. 使用☞ab213524检测不同组织来源细胞样本中 PD-L1 的表达情况。上样量 20μg。
一抗稀释比例 1:1000。二抗稀释比例 1:20000。ECL 曝光时间 180 秒。
如果在实验中不确定多条条带是否包含 PD-L1，可以按☞文献（点击查看）中的方法，先用 PNGase F 处理样本，去除糖基化后观察条带大小是否发生变化以确定是否为目的条带（图3）。
图3. 使用 PNGase F 处理细胞裂解液后 PD-L1 条带大小与理论分子量相符。
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PD-L1 的 IHC-P 检测
PD-L1 有多个克隆在临床上用于肿瘤靶向治疗的伴随诊断，根据不同的 IHC-P 染色结果预测肿瘤对于 PD-1 或 PD-L1 抑制剂的应答情况。
进行实验前，首先要了解 PD-L1 在不同肿瘤组织的表达情况，表1是肺癌中的表达情况。PD-L1 在更多癌症中的表达可以☞点这里查看更多参考。
|
肺癌类型 |
阳性样本数/ 总样本数 |
阳性比例 |
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肺腺癌 |
2/5 |
40% |
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肺鳞癌 |
1/3 |
33% |
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小细胞肺癌 |
1/2 |
50% |
表1. 部分种类肺癌中 PD-L1 表达情况。
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当使用 clone 28-8 （☞ab205921）进行 IHC-P 实验时，推荐配合 10X Universal HIER antigen retrieval reagent (☞ab208572)与 IHC detection kit HRP/DAB (☞ab209101)一起使用，并采用高压蒸汽修复切片 2min（或 120℃ 30sec，110℃ 15min）的方法进行抗原修复，以获得更好的实验结果。
当使用传统 IHC-P 实验方法信号不佳或没有信号时，除排查常见实验问题外，还可以尝试按照☞文献（点击查看）中的方法，用 PNGase F 处理样本以增强信号（图4）。