条带出现干扰？目标蛋白不够？这些NF-κB p65的实验关键点你掌握了吗？

NF-κB p65 由于蛋白的特殊性质与磷酸化、乙酰化修饰，在实验中需要特别注意。

小艾这次整理了在不同实验中检测这个蛋白的注意事项，帮助您获得预期实验结果。

NF-κB p65 实验关键点

NF-κB p65 简介

哺乳动物 NF-κB 由 5 个亚基组成，包括 p50-NF-κB1，p52-NF-κB2，c-Rel，p65-RelA 和 RelB。它们在体内形成有功能的同源或异源多聚体。

NF-κB p65 常参与炎症反应。在静息细胞中，NF-κB 主要定位于细胞质，少量以非活性复合物位于细胞核。在激活的细胞中，NF-κB 进入细胞核并激活下游相关基因转录。NF-κB 的转录活性由 p65 亚基的磷酸化或乙酰化调控。

NF-κB 信号通路可通过下述压力刺激诱导：自由基氧化、紫外线辐射 (UV)、肿瘤坏死因子 α (TNFα)、白细胞介素 1-beta(IL-1β)、病原体相关分子模式 (PAMPs) 或细菌脂多糖 (LPS)。NF-κB 与记忆和突触可塑性相关，而异常蛋白质水平则与癌症有关。

NF-κB p65 的 WB 检测

由于NF-κB p65 有很多翻译后修饰，且部分定位于细胞核，为了得到理想的实验结果，小艾建议在制备样品中注意以下几点：

1	在裂解样品时加入蛋白酶抑制剂，检测磷酸化或乙酰化 p65 时加入磷酸酶或去乙酰酶抑制剂 HDACi（TSA + 烟酰胺）（图2）。
2	对样品进行超声处理以富集更多的目标蛋白。
3	实验过程中将样品置于冰上。

图2. 检测 HeLa 细胞中 NF-κB p65 phospho S276。

Lane 1：

未处理 HeLa 全细胞裂解液

Lane 2：

100ng/ml Calyculin A 处理 30min，然后使用20ng/ml TNF-α处理5min HeLa 细胞全裂解液

Lane 3：

100ng/ml Calyculin A 处理30 min，然后使用 20ng/ml TNF-α 处理 5min，再用碱性磷酸酶处理 1 小时 HeLa 细胞全裂解液

为了确保有足够的蛋白被检测到并防止非特异反应，在电泳及检测时推荐：

1	使用 Bradford、Lowry 或 BCA 方法对总蛋白进行定量（图3）。
2	进行 SDS-PAGE 时每个泳道加入 20-50μg 总蛋白。
3	检测磷酸化蛋白时使用 BSA 进行封闭。

图3. 检测不同样本中 NF-κB p65 表达情况

Lane 1：人胎儿脑裂解液

Lane 2：人胎儿肾裂解液

Lane 3：人胎儿肺裂解液

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1. Bo-Hwa Choi, Da-Hyun Lee, Jin Kim, Ju-Hee Kang, Chang-Shin Park, Controls of Nuclear Factor-Kappa B Signaling Activity by 5'-AMP-Activated Protein Kinase Activation With Examples in Human Bladder Cancer Cells. Int Neurourol J. 2016 Sep;20(3):182-187.

2. Arenzana-Seisdedos F, Thompson J, Rodriguez MS, Bachelerie F, Thomas D, Hay RT. Inducible nuclear expression of newly synthesized I kappa B alpha negatively regulates DNA-binding and transcriptional activities of NF-kappa B. Mol Cell Biol 1995;15:2689-96.

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