艾问艾答｜WB实验的内参怎么选？这里有一张常用内参选择列表

由于实验的不确定性，严谨的 Western Blot（WB）实验设计要求有良好的参照体系。这对实验结果分析是非常有用的，也是实验中不可缺少的步骤。

良好的参照体系通常包括分子量 Marker、空载体对照、阳性对照及内参等。内参通常是在被检样本中高表达且表达水平相对稳定的蛋白。因此，我们常常选择管家基因编码的蛋白来作为内参。

WB 实验中使用内参

好处多多

WB 实验中使用内参有多种好处：用于校正上样误差，检测转膜情况以及显色或发光体系是否正常等。

校正蛋白上样量。

在 WB 实验中，比较不同样本中某种蛋白的表达量时，如果上样量有差异，无疑会严重影响实验结论。检测内参并确保各泳道间内参蛋白量一致即可排除上样量的影响。

判断转膜效率。

除了上样量，转膜时不同泳道之间的转移效率不同，也会给最终结果带来极大影响。在比较不同泳道样品中目标蛋白表达量时，可以根据内参蛋白的转印效率来确定目的蛋白是否被有效转印到膜上。

排除边界效应。

如果一次 WB 检测样本较多而使用较大的凝胶，凝胶边缘泳道在转膜时效率可能与中间的泳道效率不同。内参的设置同样可以排除边界效应的影响。

检测显色或发光体系是否正常。

由于内参蛋白在样本中通常是高表达，比较容易被检测到，因此也可作为其中一种 WB 实验的阳性对照。通过内参的信号，来判定显色或发光体系是否正常工作。

由于这些显而易见的好处，在文章发表时，通常要求设置内参来说明实验结果的有效性。

选择内参蛋白的时候

要注意几个原则

在选择内参蛋白时，我们需要遵循几个原则：

种属来源

样本的种属来源不同，内参的选择也是不一样的。哺乳动物的样本需要选择哺乳动物中稳定表达的蛋白作为内参；同样的，植物样本需要选择植物中稳定表达的蛋白做内参；

细胞定位

靶标蛋白的细胞定位不同，适合的内参也不同。如全细胞裂解液可选择 beta-actin、beta-tubulin 等，膜蛋白一般选择 Na K ATPase，核蛋白则选择 Lamin B1、Histone H3 等；

分子量

内参蛋白的分子量需要与目标蛋白有所区别，否则两者条带无法分开。一般目的蛋白与内参蛋白大小至少相差 5kDa 以上；

表达因素

内参的选择还需要考虑实际的实验环境。GAPDH 是代谢类蛋白，在活组织中表达较稳定。β-Actin 和 β-Tubulin 是结构蛋白，不同组织的细胞结构会有差异性。在组织缺氧、糖尿病等因素条件下会导致 GAPDH 的表达增高，此种情况下 GAPDH 就不适合做内参。

综上，设计实验方案的时候应该考虑实际的实验因素并查询相应文献而选择合适的内参，在实验过程中也应该注意内参表达是否出现异常。

如果要选取内参蛋白

可以参考下表

小艾为大家整理了实验中常用的内参蛋白列表，这份列表不止适用于 WB 实验，在其他实验中如果需要选取内参蛋白也可以参考：