聊聊二抗与“背景”的那些事儿

小编当年也深受其害，非特异性结合或背景干扰会严重影响我们的实验结果，不仅浪费试剂而且减缓实验进程。在WB，免疫荧光，免疫组化等各种免疫实验中，二抗被设计靶向免疫球蛋白（一抗），并用作免疫分析的检测试剂。不得不说，由二抗选择不当带来的“背景“不容小觑。

那么，我们来细谈如何选对二抗，提高特异性，让 “背景“从此是路人。

首先是种属来源，我们需要注意的是二抗的种属来源必须不同于一抗的种属来源。例如，当使用的一抗是鼠源，那么二抗必须是非鼠源的，否则就会出现假阳性。

接着，要确保二抗可以识别目标一抗，除了要考虑一抗的物种，还包括一抗的类型和亚型。

如果一抗是兔源多克隆抗体，那么需要使用抗兔的二抗。一般来说，大多数一抗是在小鼠或兔的体内制备的，因此常用的二抗是抗鼠IgG和抗兔IgG。

另外，我们要选择靶向一抗类型或亚型的二抗。譬如，当一抗是IgG1,那么二抗可以选择抗IgG1或IgG。但是选择IgG当做二抗，需要考虑IgG2/3/4带来的“背景”。

除了确保二抗识别一抗外，还有妙招提高二抗的特异性。交叉吸附指纯化后的二抗再次通过一个纯化柱，而该纯化柱上固定了其他种属来源的抗体或血清。因此，这种方法可以降低交叉反应性，从而减少背景和提升抗体效价。

特别是多重标记实验中，对富含免疫球蛋白的组织或细胞中染色时，建议使用交叉吸附过的二抗。Invitrogen提供丰富的多种属交叉吸附处理过的二抗。下图的二抗经过与牛、山羊、兔、大鼠和人IgG以及人血清的交叉吸附处理。

针对IHC和IF检测某些Fc受体表达丰富的组织比如脾脏，淋巴结等，降低非特异性还有奇招。F(ab’)2抗体片段不与Fc结合，从而大大减少背景的干扰。另外，F(ab’)2的分子量较小并且易于穿透组织，所以是IHC和IF的首选二抗。

此外，还有跟二抗标记物相关的，例如荧光染料选择不当也会造成“背景”。需要注意选择发射光谱不重叠的基团，避免信号干扰。Alexa Fluor，Alexa Fluor Plus等染料具有卓越的亮度和较高的信噪比，是您的不二选择。

还有在IHC和IF中用生物素/链霉亲和素体系检测富含生物素样本也会导致强“背景”。