艾问艾答｜WB经验分享：靶标相同，结果不同？哪里出了问题？

小师妹最近做实验又遇到问题啦！她正潜心研究细胞焦亡，现在需要用 WB 测量样品中的 GSDMD 蛋白。细心的她同时找到了重组 Anti-cleaved N-terminal GSDMD 抗体[EPR20829-408] (☞ab215203)和重组 Anti-cleaved C-terminal GSDMD 抗体[EPR20859-147] (☞ab255603)这两款抗体来进行实验，希望用这两种抗体相互对照确认自己的实验结果。

结果不对照还好，一对照她却更懵了。☞ab215203这款抗体在 WB 中检测到了 31kDa 大小的条带（图1上半部分），但 ☞ab255603 的 WB 结果却出现了一条 22kDa 大小的条带（图2上半部分）。

满脸疑惑的师妹又发现重组 Anti-GSDMD 抗体[EPR19829] (☞ab210070)检测到了 53kDa 和 22kDa 两条带（图1下半部分），Anti-GSDMD 抗体[EPR20859] (☞ab219800)却产生了一条 53kDa 和 31kDa 大小的条带（图2下半部分）。

四款同靶标的抗体却产生了四种不同的结果，这到底是是什么情况呢？不明所以的师妹跑来向小艾请教。

图1.cleaved N-terminal GSDMD 重组抗体[EPR20829-408]_cleaved N-terminal GSDMD 抗体(☞ab215203) (abcam.cn)

图2.cleaved C-terminal GSDMD 重组抗体[EPR20859-147]_cleaved C-terminal GSDMD 抗体(☞ab255603) (abcam.cn)

小艾首先对师妹这种做对照的习惯进行了重点表扬。小艾先是让师妹查查 GSDMD 是否有不同的剪切体或亚型存在。果不其然，当细胞焦亡发生时， GSDMD 全长蛋白可以被活化的 caspase 蛋白剪切成为 GSDMD-N 和 GSDMD-C 两部分，其中 GSDMD-N 段蛋白又会进一步在细胞膜上打孔引起细胞焦亡的后续反应。

从这几款产品的名字中也可以看出一些抗体的区别来，☞ab215203 这款抗体识别的是剪切后的 GSDMD-N 段蛋白（31kDa）， ☞ab255603 识别的却是剪切后的 GSDMD-C 段蛋白（22kDa）。

虽然从 ☞ab210070 和 ☞ab219800 的名称上无法判定它们识别的是 GSDMD 的哪种形式，但结合 WB 结果可以看出，☞ab210070 可以同时识别未发生剪切的 GSDMD 全长蛋白（53kDa）和剪切后的 GSDMD-C 段蛋白（22kDa），而☞ab219800 可以同时识别未发生剪切的 GSDMD 全长蛋白（53kDa）和剪切后的 GSDMD-N 段蛋白（31kDa）。

GSDMD 蛋白被活化的 caspase 剪切是细胞焦亡过程中的关键步骤(☞点这里查看图片来源）

有些蛋白质存在不同剪切体或亚型，针对这类蛋白，虽然是检测相同的靶标蛋白，但针对不同识别位点的抗体可能会出现不同结果，就像如上不同货号抗体的 WB 实验中出现不同条带的结果一样。

还有一种情况，当抗体靶标为外源重组蛋白时，检测到的大小即为重组片段的大小而不一定是蛋白全长。同时由于蛋白质片段化以及外源标签可能破坏或者封闭抗体识别位点，从而造成有的抗体检测不到相应条带的情况。

小师妹这也是第一次碰到这样的问题，下一次她再碰到这种情况相信就不会再犯难啦。希望小艾的这些经验也对您的实验有帮助哦~