靶点解惑 | WB必备！99%科学家都不能错过的实验检查清单
WB 实验是最常用的技术手段，而与 WB 实验交手，却常常让科研人员轻则血压升高、重则彻夜难眠。
那么为何别人的条带清晰美如画，而自己的条带却问题频出，让人抓狂呢？今天小艾整理了 WB 实验中需要特别关注的小细节，前方干货预警，可先收藏再继续看哦～
另外，我们还贴心为您准备了 WB 实验的check list，实验常常出错的小伙伴可以对照着这张表来检查是否遗漏了哪些关键点哦！
WB 实验关键点
WB实验流程
WB 实验流程通常包括样本制备、电泳、转膜、封闭、抗体孵育和检测 6 个部分（图1）。这 6 个部分是环环相扣，每一步的疏忽都可能导致一无所获。
图1.WB实验流程
样本选择和处理
蛋白分子参与生命活动的各个过程，其功能复杂多样，有些蛋白可能只在部分组织和细胞表达（图2）。有些蛋白可能需要诱导，才能表达或表达量增加（图3）。有些蛋白可能存在翻译后修饰，导致其蛋白分子量大小可能与预测不符（图3，4）。有些蛋白可能有多个异构体或者容易被降解，导致出现多条条带的现象（图3）。因此，只有足够了解您研究的蛋白特性，您才能在样本的选择和处理上得心应手，美美的开启您的 WB 之旅。
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样本制备
样本制备是 WB 实验的开端，裂解液的选择、样本的破碎方法、温度和变性等都会影响样本制备是否成功。
小艾根据多年经验，整理了一些样本制备过程中需关注的小细节：
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1 |
添加复合蛋白酶抑制剂以避免靶标蛋白降解。如果涉及蛋白修饰的检测，需添加相应的去修饰酶抑制剂，例如对于磷酸化修饰蛋白添加复合磷酸酶抑制剂，以防止蛋白在提取时被去磷酸化。 |
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2 |
选择合适的裂解液来富集更多靶标蛋白。 |
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3 |
超声破碎处理细胞以富集更多靶标蛋白（图5）。 |
图5.超声处理富集 THP-1 细胞中的
Histone H3 蛋白
Lane 1：
超声处理 THP1 全细胞裂解液
Lane 2：
未处理 THP-1 全细胞裂解液
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4 |
整个样本制备过程中，保持样本置于冰上。 |
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5 |
一般来说，95℃ 变性 5-10min。对于有些多次跨膜蛋白，37℃ 或者 70℃ 10min 可能效果更好。 |
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6 |
通过 Bradford 分析、Lowry 分析或 BCA 分析测定样本蛋白浓度。 |
电泳
电泳可以将靶标蛋白与其它蛋白分开，更易检测。不同浓度的分离胶对不同分子量的蛋白分离效果是不同的。蛋白的上样量，也会影响是否可以检测到有效信号或者获得漂亮的图片。设置阳性和阴性对照不仅有助于分析蛋白功能，在 WB 实验失败时也有助于分析失败的原因。
小艾在电泳时会特别关注以下小细节：
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1 |
根据蛋白大小选择合适的电泳胶浓度，以确保不同蛋白的迁移速率与分离程度最优。具体可参考表1。 |
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蛋白的分子量大小 |
分离凝胶丙烯酰胺百分比 |
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4–40 kDa |
20% |
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12–45 kDa |
15% |
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10–70 kDa |
12.5% |
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15–100 kDa |
10% |
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25–200 kDa |
8% |
表1.不同浓度的分离胶选择
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2 |
对于分子量较小的靶标蛋白(如分子量<25 kDa），请使用较高浓度的分离胶进行电泳。 |
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3 |
对于分子量较大的靶标蛋白（如分子量>100 kDa），请使用较低浓度的分离胶进行电泳。 |
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4 |
至少上样 20μg 总蛋白进行电泳。 |
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5 |
建议使用阳性和阴性对照。 |
转膜
转膜是指将蛋白从电泳胶上转移到膜上，方便目标蛋白的检测。转膜缓冲液中 SDS 和甲醇含量对不同分子量蛋白的转膜影响是不同的（图6）。PVDF 膜孔径的选择依赖于蛋白分子量大小。转膜结束后，丽春红染色使蛋白可视化，方便判断转膜是否成功（图7）。
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小艾在转膜时会特别关注以下小细节：
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1 |
对于分子量较大的靶标蛋白，建议在转膜缓冲液中加入 SDS 至终浓度为 0.1%。 |
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2 |
对于分子量较大的靶标蛋白，建议使用 0.45μm 的 PVDF 膜。 |
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3 |
对于分子量较小的靶标蛋白，建议使用 0.22μm 的 PVDF 膜。 |
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4 |
对于分子量较大的靶标蛋白，建议转膜缓冲液中使用 10% 甲醇或更低浓度。 |
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5 |
对于分子量较小的靶标蛋白，建议转膜缓冲液中使用 20% 甲醇。 |
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6 |
PVDF 膜激活完成后充分清洗，完全去除膜上残留甲醇。 |
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7 |
转膜开始前请确认胶与膜之间没有任何气泡。 |
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8 |
建议转膜完成后使用丽春红染色，确定转膜是否成功（如果选择荧光标记检测，请确保丽春红完全清洗干净）。 |
封闭
封闭是使未有蛋白吸附的区域被封闭，以防止抗体的非特异性结合，从而降低背景，提高检测灵敏度。常用的封闭液有 5% 脱脂奶粉和 5% BSA 或特定封闭液。
小艾在封闭时会特别关注以下小细节：
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1 |
没有适用于所有体系的封闭液，请选择合适的封闭液（图8） |
图8.使用 ab32034 检测 p27 KIP1 时，
不同封闭液封闭效果不同。
Lane 1：
2% BSA
Lane 2：
5% BSA
Lane 3：
5% NFDM/TBST
抗体孵育
抗体孵育通常包括一抗孵育和二抗孵育，一抗可特异性地和靶蛋白相互结合；二抗能辨认一抗的恒定区（具有物种特异性），具有放大信号的作用。
小艾在抗体孵育时会特别关注以下小细节：
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1 |
在 WB 实验过程中，请避免干膜情况。 |
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2 |
请根据产品说明书选择合适的抗体工作浓度。如果不清楚给定的未纯化抗体样品的浓度，请参考表2。 |
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组织培养 上清 |
腹水 |
全抗 血清 |
纯化的 抗体 |
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WB |
1/100 |
1/1000 |
1/500 |
1g/ml |
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浓度 估计 |
1-3 mg/ml |
5-10 mg/ml |
110 mg/ml |
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表2.抗体使用浓度参考表
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4 |
建议使用新鲜抗体，不建议抗体重复利用。 |
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5 |
抗体孵育时，膜尽量不要裁剪 |
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6 |
抗体孵育后充分洗涤，去除非特异性结合 |
检测
二抗通常带有标签，以用作检测。常见检测手段有化学发光和荧光标记等。
小艾在检测时会特别关注以下小细节：
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1 |
化学发光检测 ➣ 显色底物的选择，现配现用，避光处理 ➣ 显色底物全覆盖在膜上，避免不均 |
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2 |
荧光检测 ➣ 溴酚蓝也会有产生荧光的倾向，最好让它离目的条带远一些 |
以上就是小艾整理的在 WB 实验中需要注意的细节啦！不管你是做哪个靶点，这些技巧都是可以适用的哦！
担心遗漏这些细节点的小伙伴也不要着急，欢迎下载我们为您准备的 WB 实验 check list，边做实验边检查，相信一定会获得满意的实验结果！