应用指导 | WB、免疫沉淀、ELISA等技术中，融合标签怎么用？

用于结构研究的技术，如核磁共振（NMR）光谱学、X 光晶体学和低温电子显微镜，需要优质纯蛋白进行分析¹。这意味着依靠洗涤剂或还原剂的纯化方法可能不适用，因为这些方法可能会妨碍优质晶体的形成或者影响蛋白结构¹。

将融合标签连接到您的目标蛋白上，就可以通过提升产率、增加溶解度以及给靶点提供已知表位的方法来提高分离靶点的能力。结构研究的缺点是，融合标签可能会阻止有序晶体形成，并且对于 NMR 研究来说太大。

从蛋白中切割标签则可以解决这一问题，但这样会增加实验成本。虽然如此，仍有超过 75% 的纯化结晶蛋白与融合标签连接。一些标签可能比其他标签更适合结构研究，因此务必仔细考虑您的实验设计。

纯化后产生具有功能活性的蛋白对某些研究而言至关重要，尤其是那些潜在疗法的研究¹。功能研究的一个主要方面是保留正确的信号域和准确的蛋白质折叠。因此，小标签可能是首选，因为小标签不太可能影响蛋白质功能。标签的位置对这些研究也很关键，因为位置不正确会降低正确的表达量。如果蛋白的结构是已知的，则有助于确定最佳位置。

表位和荧光标签都是评估目标蛋白定位的重要工具。免疫荧光显微镜是最常见的可视化技术，既可以直接通过荧光标签实现，也可以间接通过免疫检测实现。还可以用于发现蛋白的哪些区域有助于定位²。

可以对细胞先分级，然后进行分析，以确定融合蛋白，从而帮助确定蛋白在特定亚细胞区室的定位²。

由于荧光标签无毒，因此可用于观察活细胞中蛋白的运动。

如果想把某一基因导入某一细胞，可以用融合标签来保证该基因的表达。也可以使用相同或不同的标签评估两个基因的共表达²。

重组蛋白还用于在原核系统中表达真核蛋白。该技术通常用于获得高水平的目标蛋白，以便开展后续研究。以这种方式分离真核蛋白面临的挑战之一是：20-40% 的真核蛋白不能在原核系统中以可溶形式表达¹。融合标签（如 GST 或 MBP）可以通过增加目标蛋白的溶解度来帮助克服这一障碍。

亲和层析、免疫沉淀 (IP) 和蛋白复合体免疫沉淀 (co-IP) 是最常见的蛋白纯化技术²。尽管这些方法都采用了上述四个步骤，但每种技术使用的固定基质不同。

亲和层析常使用色谱柱作为固定相，并利用氢键或离子键等分子特性。首先让粗裂解液流经色谱柱，使目标蛋白结合，然后洗去多余的裂解液。可添加特定缓冲液或溶液，从色谱柱中洗脱目标蛋白。

另一方面，IP 的固定相为目标蛋白的抗体。将细胞裂解液与固定相一同孵育，促使抗体与溶液中的蛋白结合。然后使用蛋白 A/G 偶联琼脂糖微珠将抗体/抗原复合体从样本中分离，用于后续分析。例如，通过 SDS-PAGE 进行分离，用于 Western Blot 分析。

Co-IP 也可使用抗体结合已知的靶点，但其目的是将目标蛋白连同其结合的任何其他蛋白一起分离。通过这种方式，可以找到新的结合伴侣或蛋白质网络¹。为全面了解与主要已知蛋白相关的蛋白网络，后续实验通常包括使用其他分离中发现的蛋白作为靶点进行重复 co-IP。

虽然找到目标蛋白的最佳标签需要一定的时间，但良好的开端是成功的一半。因此，我们列出了一些广泛使用的标签，并提供了这些标签的分子量比较 [图 1]。

▲ 图 1：广泛使用的融合标签的分子量比较