流式细胞术做蛋白磷酸化检测的步骤和疑问

蛋白质磷酸化是翻译后修饰(PTM)领域研究最深入的，三磷酸腺苷(ATP)中的磷酸基通过激酶共价连接到丝氨酸(~ 86%)、苏氨酸(~ 12%)或酪氨酸(~ 2%)上（也可以是其它氨基酸，相对少见），然后被磷酸酶去除。

磷酸化可以改变蛋白质的结构、功能和相互作用。因此，磷酸化在体内稳态和疾病的几乎所有细胞过程中都起着关键作用，包括信号转导、细胞周期、分化、增殖、代谢、活动和死亡。重要的是，不同残基上的磷酸化会导致不同的结果。例如，RAF1是MAPK通路的中心激酶，当它在丝氨酸(S)或苏氨酸(T)残基S259、S338、S340/341、T491或S494处磷酸化时会被活化，然而，如果在S289/296/301处磷酸化就会导致RAF1激酶活性的抑制。所以，了解磷酸化的特定位点和水平对于理解细胞信号和表型至关重要。

研究蛋白质磷酸化方法很多，有：十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、Westernblot、流式细胞术、激酶测定法、酶联免疫法、质谱法等等，但实际上，这里面只有流式是唯一的单细胞磷酸化分析技术，而其它技术都是需要裂解细胞提取蛋白质分析，所以反映的是整个细胞群体蛋白质磷酸化状态的平均值，无法收集一个群体中单个细胞蛋白质磷酸化的信息，也没有能力追溯和识别磷酸化蛋白质相对应的细胞群体。

因此，如有可能，请大家尽量用流式来做磷酸化检测。

对于磷酸化流式，在此奉上一个磷酸化蛋白单染的Protocol，希望对大家有帮助。

试剂

1.1X PBS (磷酸盐缓冲液)：1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4、8g NaCl、0.2g KCl，溶解在850 mL蒸馏水中，用HCl调节pH至7.4，最后定容至1升。保存在室温。2.胎牛血清(标准细胞培养FCS)。在4°C下保存。3.甲醛：可以自己配制也可以购买4-36%的多聚甲醛储存液，室温保存。4.甲醇。5.染色缓冲液：1X PBS+4%FCS+1 mM叠氮化钠。4°C保存。6.EDTA：配制5M原液，用于制备PBS-EDTA缓冲液。EDTA用于避免流式细胞仪采集过程中的细胞成团。室温保存。7.PBS-EDTA：PBS+1 mM EDTA。室温保存。

步骤

1.细胞培养采用标准组织培养板(6孔板、12孔板或24孔板)，每孔接种1×10E6个/mL。例如，Jurkat细胞虽然可以作为T细胞研究的模型，但在PTEN和SHIP-1磷酸酶中存在遗传缺陷，故只能通过AKT和PI3激酶效应通路持续传递信号。与需要外源刺激才能增殖的初始T细胞相比，这些基因突变使Jurkat细胞能够在培养中增殖。在染色前，确定最佳抗体浓度很关键，确定好之后，就可以计算所需的细胞量和抗体量。2.加入所需浓度的细胞刺激。除未刺激/刺激样本外，还应准备对照(如有同型对照，或进行间接染色时还需设置仅染二抗的对照)。37°C继续孵育15分钟。3.直接在细胞培养中加入高浓度甲醛溶液，使甲醛的最终浓度为1-2%(即如果使用16%的甲醛，则加入100μL/mL的样品)。旋转平板以均匀混匀固定剂，然后放回37°C 15分钟。4.用移液器充分吹打样本，然后将样本转移到流式管中，并将样品放在冰上。由于固定剂的存在，细胞容易粘附在塑料上，所以这一步吹打的时候要注意。转移完成后，通过显微镜检查培养板，确定细胞已被完全移除，因为这是新手经常严重丢失细胞的环节。5.4℃，500g离心5分钟。6.流式管放在涡旋震荡器上(中速)，向细胞管中加入1毫升冰冷甲醇，对细胞进行破膜。甲醇的添加速度也是有要求的，建议每1毫升2-3秒加完，最后流式管置冰上静止15分钟。7.用2-4mL的PBS清洗细胞三次，以确保甲醇的去除。如果甲醇仍然存在，用染色缓冲液清洗可能会导致FCS蛋白沉淀，因此应避免。8.将细胞重悬在染色缓冲液中，调节细胞密度，接着按照25~100μL体积分到染色管中，并保证每管有0.5-1×10E6个细胞。要知道，每管染色的细胞数量越少，流式细胞仪采集所需的时间就越长，因此进行相应的调整非常重要。9.将一抗加入细胞中，孵育30分钟(有些抗体可能需要更长的孵育时间，例如60分钟)。10.用1mLPBS洗涤细胞2次，再重悬于100μL的PBS-EDTA中。如果一抗是带荧光素的，那么现在可以上机获取了。如果做间标的话，则加入二抗继续染15分钟，再用PBS洗涤两次，最后重悬于100μL的PBS-EDTA中，上机获取。

关于样本保存

论坛上，常有站友问到，样本是否需要马上固定，固定后能保存多久？按照这篇Protocol里面提到的，虽然Krutzik等人没有直接提到是否需要马上固定，但是从步骤以及Note8里面说的情况来看，样本是需要马上固定和破膜的，只是固定破膜后（也就是做到步骤的第6步），是可以较长时间保存的，作者测试了数天至2~3周，是可以做出来的